多肽藥物有關(guān)物質(zhì)分析方法開發(fā)的關(guān)鍵策略與實(shí)踐?！
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作為介于小分子化學(xué)藥物與生物大分子藥物之間的特殊品類，多肽藥物憑借高特異性、低毒性的優(yōu)勢(shì)，在代謝性疾病、腫瘤、抗感染等領(lǐng)域的研發(fā)熱度持續(xù)攀升。然而，多肽分子獨(dú)特的理化性質(zhì)與復(fù)雜的雜質(zhì)譜(尤其是結(jié)構(gòu)相近的肽相關(guān)雜質(zhì))，使其有關(guān)物質(zhì)分析成為藥物研發(fā)與質(zhì)量控制的核心難點(diǎn)。下面小編將圍繞多肽藥物的分子特性，系統(tǒng)梳理反相色譜、離子交換色譜、體積排阻色譜等主流分析技術(shù)的開發(fā)要點(diǎn)，為多肽藥物的質(zhì)量合規(guī)提供全面參考。?
一、多肽分子特性對(duì)有關(guān)物質(zhì)分析的核心影響?
多肽藥物由氨基酸通過肽鍵連接形成，其分子結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)的特殊性，直接決定了有關(guān)物質(zhì)分析方法的開發(fā)難度，主要體現(xiàn)在以下四方面：?
(一)分子量與色譜行為的關(guān)聯(lián)?
多肽分子量通常在 500-5000 Da 之間(如明星藥物司美格魯肽分子量達(dá) 4114 Da)，雖低于生物大分子，但遠(yuǎn)高于小分子藥物。較大的分子量導(dǎo)致其在流動(dòng)相中擴(kuò)散速率慢，易引發(fā)柱效下降、峰寬增加;同時(shí)，多肽對(duì)有機(jī)相比例(B%)極為敏感，微小變化(如 ±1%)即可導(dǎo)致保留時(shí)間大幅波動(dòng)，增加方法穩(wěn)定性控制難度。?
(二)高級(jí)結(jié)構(gòu)的干擾?
多肽鏈可通過 α 螺旋、β 折疊形成二級(jí) / 三級(jí)結(jié)構(gòu)，僅表面氨基酸殘基能與色譜固定相接觸，導(dǎo)致相同序列多肽可能因構(gòu)象差異表現(xiàn)出不同色譜行為，影響雜質(zhì)與主成分的分離效果。?
(三)順反異構(gòu)體的峰型問題?
肽鍵(酰胺鍵)具有部分雙鍵性質(zhì)，易形成順反異構(gòu)體，尤其在分析含脯氨酸等殘基的多肽時(shí)，易出現(xiàn)峰型展寬、分裂，降低檢測(cè)靈敏度。?
(四)兩性屬性與雜質(zhì)譜復(fù)雜性?
多肽分子同時(shí)含羧基(酸性)與氨基(堿性)，存在特定等電點(diǎn)(pI)，在不同 pH 條件下電離狀態(tài)差異顯著;且合成過程中易產(chǎn)生差相肽(如缺失 / 多余氨基酸、氨基酸取代)、降解雜質(zhì)(如氧化、水解產(chǎn)物)，這些雜質(zhì)與主成分結(jié)構(gòu)高度相似，色譜行為接近，分離難度極大。?
正如國(guó)家藥監(jiān)局藥審中心(CDE)在《合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中強(qiáng)調(diào)，多肽藥物有關(guān)物質(zhì)分析需針對(duì)性解決 “雜質(zhì)與主成分分離難、方法穩(wěn)定性差、定量準(zhǔn)確性低” 三大痛點(diǎn)，這也要求方法開發(fā)過程中需結(jié)合分子特性進(jìn)行系統(tǒng)性優(yōu)化。?
二、主流色譜技術(shù)在多肽有關(guān)物質(zhì)分析中的應(yīng)用與優(yōu)化?
目前，多肽藥物有關(guān)物質(zhì)分析以高效液相色譜(HPLC)技術(shù)為主，根據(jù)分離機(jī)制不同，可分為反相色譜(RP-HPLC)、離子交換色譜(IEC)、體積排阻色譜(SEC)三類，其中反相色譜因適用性廣成為首選，后兩類可作為補(bǔ)充技術(shù)解決復(fù)雜雜質(zhì)分離問題。?
(一)反相色譜法(RP-HPLC)：多肽有關(guān)物質(zhì)分析的核心技術(shù)?
反相色譜通過多肽分子與固定相(如 C18)的疏水相互作用實(shí)現(xiàn)分離，適用于大多數(shù)多肽藥物的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)，其方法優(yōu)化需重點(diǎn)關(guān)注色譜柱選擇、流動(dòng)相配置及關(guān)鍵參數(shù)調(diào)控三方面。?
1. 色譜柱選擇：適配多肽分子擴(kuò)散與結(jié)構(gòu)特性?
多肽分子擴(kuò)散慢、易與固定相產(chǎn)生非特異性吸附，色譜柱的選擇直接決定分離效率與方法穩(wěn)定性，需從以下維度考量：?
填料類型：表面多孔型硅膠填料(如核殼結(jié)構(gòu))可縮短多肽分子在顆粒內(nèi)部的擴(kuò)散路徑，減少譜帶展寬，顯著提升柱效，尤其適用于分子量 > 2000 Da 的多肽;全多孔硅膠填料則需選擇小粒徑(如 1.7-3 μm)，雖會(huì)增加柱壓，但對(duì)多肽分離的收益優(yōu)于小分子藥物。?
孔徑選擇：10-12 nm 孔徑的色譜柱可滿足多數(shù)多肽需求，既能允許多肽分子進(jìn)入孔隙與固定相結(jié)合，又可避免因孔徑過小導(dǎo)致的傳質(zhì)阻力增加。?
固定相鍵合相：C18 是基礎(chǔ)選擇，可提供強(qiáng)疏水作用;對(duì)于含酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族殘基的多肽，苯基柱(如 Phenyl-Hexyl)可通過 π-π 相互作用增強(qiáng)選擇性;此外，封端 / 不封端、嵌合極性基團(tuán)(如氨基、氰基)的色譜柱，可減少硅醇基與多肽氨基的次級(jí)相互作用，改善峰型。?
由于不同廠家色譜柱的選擇性差異較大(如鍵合密度、端基封尾工藝)，方法開發(fā)階段需通過多柱篩選確定最優(yōu)方案。例如，可參考 Snyder/Dolan 法(通過 H、S、A、B、C 參數(shù)表征選擇性)或借助供應(yīng)商數(shù)據(jù)庫篩選差異顯著的色譜柱;若需提升效率，采用自動(dòng)化方法開發(fā)平臺(tái)(如集成多柱切換、智能梯度優(yōu)化功能)可大幅縮短篩選周期 —— 這與專業(yè)機(jī)構(gòu)的技術(shù)路徑高度契合，例如恒譜生在多肽方法開發(fā)與驗(yàn)證中，便依托自主研發(fā)的多柱篩選技術(shù)與設(shè)備，結(jié)合 10 萬 + 化合物潛庫比對(duì)，快速定位適配的色譜柱類型，解決 “盲目試柱、效率低下” 的痛點(diǎn)。?
2. 流動(dòng)相配置：平衡保留、選擇性與峰型?
流動(dòng)相需兼顧多肽的保留能力、雜質(zhì)分離度與溶解度，關(guān)鍵優(yōu)化方向包括：?
緩沖體系：三氟乙酸(TFA)是首選添加劑，濃度通常為 0.1%(V/V)，其不僅能提供穩(wěn)定的 pH 環(huán)境(約 2.0)，還可與多肽氨基形成離子對(duì)，增強(qiáng)疏水保留;若需更高離子強(qiáng)度，可選用 50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，減少多肽分子間的排斥作用，改善峰型展寬;對(duì)于難分離雜質(zhì)，可加入離液劑(如六氟磷酸銨、高氯酸鈉)，通過改變水相極性調(diào)整選擇性，且其在乙腈 – 水體系中溶解度更高，避免結(jié)晶析出。?
pH 調(diào)控：需根據(jù)多肽等電點(diǎn)(pI)設(shè)定流動(dòng)相 pH，通常避開 pI±1.0 范圍(防止多肽溶解度驟降、析出堵塞色譜柱);例如，pI=7.0 的多肽，可選擇 pH=5.0 或 pH=9.0 的流動(dòng)相，通過改變多肽電離狀態(tài)優(yōu)化保留與分離。?
有機(jī)相選擇：乙腈是主流有機(jī)相，因其紫外吸收低、粘度小，可減少基線噪音與柱壓，且峰型優(yōu)于甲醇、異丙醇;若部分雜質(zhì)與主成分分離度不足，可少量添加甲醇(5%-10%)或異丙醇，通過調(diào)整疏水相互作用強(qiáng)度改變選擇性。?
梯度程序：鑒于多肽對(duì) B% 敏感，需采用緩慢梯度(如每 10 分鐘增加 5%-10% 乙腈)，避免保留時(shí)間波動(dòng)過大;例如，分析含 10-20 個(gè)氨基酸的多肽時(shí)，可設(shè)置初始 B% 為 5%，維持 5 分鐘后以 0.5%/min 的速率升至 40%，確保雜質(zhì)與主成分充分分離。?
3. 關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化：提升方法穩(wěn)定性與靈敏度?
柱溫：高柱溫(如 40-60℃)可降低流動(dòng)相粘度、加速多肽分子擴(kuò)散，改善峰型與分離度，還能抑制肽鍵順反異構(gòu)，減少峰分裂;但需注意，高溫可能導(dǎo)致多肽降解(如 Asp-Pro 鍵水解)或縮短色譜柱壽命，需通過強(qiáng)制降解試驗(yàn)驗(yàn)證穩(wěn)定性，必要時(shí)對(duì)柱前流動(dòng)相進(jìn)行預(yù)熱。?
檢測(cè)波長(zhǎng)：多數(shù)多肽缺少共軛結(jié)構(gòu)，需選擇酰胺鍵的末端吸收波長(zhǎng)(210-220 nm)，雖基線噪音較高，但靈敏度優(yōu)于芳香族殘基的吸收波長(zhǎng)(如 280 nm);若多肽含色氨酸、酪氨酸，可采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)(如 214 nm 與 280 nm)，輔助確認(rèn)雜質(zhì)與主成分的一致性。?
稀釋液匹配：需確保樣品稀釋液的 pH 與溶劑強(qiáng)度和初始流動(dòng)相一致，避免因溶劑效應(yīng)導(dǎo)致峰型展寬或保留時(shí)間偏移;例如，初始流動(dòng)相為 0.1% TFA – 水(95:5)，稀釋液也應(yīng)采用相同體系。?
儀器選擇：超高效液相色譜(UPLC)因高柱效、高流速特性，是多肽分析的首選;若使用常規(guī) HPLC，需選擇低死體積系統(tǒng)(如小徑管路、低擴(kuò)散進(jìn)樣閥)，減少系統(tǒng)峰展寬。?
(二)離子交換色譜法(IEC)：復(fù)雜雜質(zhì)分離的補(bǔ)充技術(shù)?
當(dāng)反相色譜無法有效分離極性差異顯著的雜質(zhì)(如強(qiáng)酸性 / 堿性降解產(chǎn)物)時(shí)，離子交換色譜可通過多肽與固定相的靜電相互作用實(shí)現(xiàn)分離，其核心優(yōu)化方向如下：?
1. 流動(dòng)相設(shè)計(jì)?
緩沖液：需根據(jù)多肽 pI 設(shè)定 pH，陽離子交換色譜(CEC)的 pH 應(yīng)低于 pI 1.0 以上(使多肽帶正電，與固定相磺酸基結(jié)合)，陰離子交換色譜(AEC)的 pH 應(yīng)高于 pI 1.0 以上(使多肽帶負(fù)電，與固定相季銨基結(jié)合);磷酸鹽是首選緩沖鹽，可通過調(diào)整濃度(20-100 mmol/L)調(diào)控離子強(qiáng)度。?
反離子：通過改變反離子種類與濃度調(diào)整保留強(qiáng)度，例如 CEC 中可選用 Na?、K?(保留強(qiáng)度：Na?
有機(jī)相：添加 5%-15% 乙腈可減少多肽與固定相的疏水相互作用，改善峰型，避免非特異性吸附。?
2. 色譜柱選擇?
載體：硅膠載體需選擇寬 pH 耐受范圍(如 2-10)的類型，聚合物載體(如苯乙烯 – 二乙烯基苯)則適用于極端 pH 條件(如 1-13)，但柱效略低于硅膠載體。?
固定相：強(qiáng)陽離子交換(SCX，含 – SO??)、強(qiáng)陰離子交換(SAX，含 – N (CH?)??)適用于大多數(shù)多肽，弱離子交換固定相(如 – WCX 含 – COOH、-WAX 含 – NH?)則適用于易降解的多肽。?
3. 其他參數(shù)?
柱溫、流速可參考反相色譜，通常柱溫設(shè)為 30-40℃，流速 1.0-1.5 mL/min，確保分離效率與峰型穩(wěn)定。?
(三)體積排阻色譜法(SEC)：聚合物雜質(zhì)分析的專屬技術(shù)?
體積排阻色譜通過多肽分子體積差異實(shí)現(xiàn)分離，主要用于檢測(cè)多肽藥物中的聚合物雜質(zhì)(如二聚體、多聚體)，其方法優(yōu)化需聚焦色譜柱與流動(dòng)相適配性：?
1. 色譜柱選擇?
填料：優(yōu)先選擇硅膠表面修飾二醇基的填料，可減少多肽與硅膠的疏水作用和靜電相互作用，避免吸附;孔徑選擇 12 nm，可滿足分子量 1000-10000 Da 多肽的聚合物分離需求。?
粒徑：選擇 3-5 μm 小粒徑填料，提升柱效，改善聚合物與主成分的分離度;色譜柱長(zhǎng)度通常為 300 mm，確保充分分離。?
2. 流動(dòng)相設(shè)計(jì)?
緩沖體系：可選用 0.1% TFA 或 50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，調(diào)控 pH 至多肽可溶性范圍(避開 pI±1.0)，同時(shí)加入 0.1%-0.5% NaCl 提升離子強(qiáng)度，減少靜電吸附。?
有機(jī)相：添加 20%-30% 乙腈或甲醇，降低多肽與填料的疏水相互作用，改善峰型;需注意有機(jī)相比例不可過高，避免多肽析出。?
流速：因多肽分子擴(kuò)散慢，需采用低流速(0.5-0.8 mL/min)，延長(zhǎng)保留時(shí)間，提升柱效;若流速過快，易導(dǎo)致聚合物峰與主成分峰重疊。?
3. 系統(tǒng)適用性?
需驗(yàn)證色譜柱的分子量排阻范圍，確保主成分與聚合物雜質(zhì)的保留時(shí)間差異顯著，且理論塔板數(shù)符合要求(通常 > 2000)。?
三、多肽有關(guān)物質(zhì)方法開發(fā)的關(guān)鍵原則與驗(yàn)證要點(diǎn)?
多肽有關(guān)物質(zhì)方法開發(fā)是系統(tǒng)性工程，需遵循 “針對(duì)性優(yōu)化、多技術(shù)互補(bǔ)、全流程驗(yàn)證” 三大原則，同時(shí)結(jié)合法規(guī)要求完成方法驗(yàn)證，確保方法的科學(xué)性與合規(guī)性。?
(一)方法開發(fā)核心原則?
基于分子特性設(shè)計(jì)方案：先通過氨基酸序列分析多肽的 pI、疏水基團(tuán)含量、易降解位點(diǎn)(如 Met、Cys 易氧化，Asp-Pro 易水解)，初步確定色譜模式(如疏水強(qiáng)的多肽優(yōu)先選反相色譜，極性強(qiáng)的多肽優(yōu)先選離子交換色譜)。?
多色譜模式互補(bǔ)：?jiǎn)我簧V模式難以覆蓋所有雜質(zhì)，需結(jié)合反相、離子交換、體積排阻色譜進(jìn)行 “正交驗(yàn)證”，例如反相色譜檢測(cè)差相肽與降解雜質(zhì)，離子交換色譜檢測(cè)極性雜質(zhì)，體積排阻色譜檢測(cè)聚合物雜質(zhì)，確保雜質(zhì)無遺漏。?
借助技術(shù)工具提升效率：面對(duì)復(fù)雜的參數(shù)篩選(如色譜柱、pH、梯度)，可采用自動(dòng)化方法開發(fā)平臺(tái)或?qū)I(yè)技術(shù)服務(wù)支持，縮短方法開發(fā)周期，降低試錯(cuò)成本。?
(二)方法驗(yàn)證關(guān)鍵指標(biāo)?
根據(jù)《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》(ChP 2020 年版)，多肽有關(guān)物質(zhì)方法需重點(diǎn)驗(yàn)證以下指標(biāo)：?
專屬性：通過空白基質(zhì)干擾試驗(yàn)(確認(rèn)輔料無干擾)、強(qiáng)制降解試驗(yàn)(酸、堿、氧化、高溫、光照降解)，驗(yàn)證主成分與各雜質(zhì)峰的分離度 > 1.5;若采用質(zhì)譜檢測(cè)，需確認(rèn)雜質(zhì)的分子量與結(jié)構(gòu)，避免假陽性。?
線性與范圍：針對(duì)主成分與主要雜質(zhì)，配制 5 個(gè)濃度梯度(通常覆蓋定量限至 120% 限度濃度)，線性回歸系數(shù) R2>0.999.確保定量準(zhǔn)確性。?
準(zhǔn)確度與精密度：準(zhǔn)確度通過低、中、高(80%、100%、120% 限度濃度)加標(biāo)回收率驗(yàn)證，回收率應(yīng)在 90%-110% 之間;精密度包括日內(nèi)精密度(同一時(shí)間 6 次進(jìn)樣，RSD<5%)與日間精密度(不同時(shí)間 3 天進(jìn)樣，RSD<8%)，確保方法穩(wěn)定性。?
檢出限(LOD)與定量限(LOQ)：通過信噪比法(S/N=3 為 LOD，S/N=10 為 LOQ)或空白基質(zhì)加標(biāo)法確定，LOQ 需滿足雜質(zhì)限度的檢測(cè)需求(通常 LOQ<50% 雜質(zhì)限度)。?
系統(tǒng)適用性：每次檢測(cè)前需驗(yàn)證理論塔板數(shù)(>3000)、分離度(>1.5)、拖尾因子(0.8-1.2)、重復(fù)進(jìn)樣 RSD(<2%)，確保色譜系統(tǒng)穩(wěn)定。?
梯度重現(xiàn)性：連續(xù)進(jìn)樣 6 次，考察流動(dòng)相梯度對(duì)保留時(shí)間、峰面積的影響，保留時(shí)間 RSD<2%，峰面積 RSD<5%，避免因梯度波動(dòng)導(dǎo)致雜質(zhì)漏檢。?
四、總結(jié)與專業(yè)技術(shù)服務(wù)參考?
多肽藥物有關(guān)物質(zhì)分析方法開發(fā)面臨 “分子特性復(fù)雜、雜質(zhì)分離難、方法穩(wěn)定性要求高” 三大挑戰(zhàn)，需結(jié)合反相、離子交換、體積排阻等多色譜技術(shù)，從色譜柱、流動(dòng)相、儀器參數(shù)等維度進(jìn)行系統(tǒng)性優(yōu)化。未來，隨著多肽藥物向長(zhǎng)鏈化、修飾化(如 PEG 化、脂肪酸修飾)方向發(fā)展，有關(guān)物質(zhì)分析將面臨更高要求，需進(jìn)一步借助智能化方法開發(fā)工具、高分辨檢測(cè)技術(shù)(如 UHPLC-Q-TOF)，以及專業(yè)技術(shù)服務(wù)支持。?
在實(shí)際操作中，企業(yè)可依托專業(yè)機(jī)構(gòu)的技術(shù)能力提升方法開發(fā)效率與合規(guī)性。例如恒譜生針對(duì)多肽藥物有關(guān)物質(zhì)分析的痛點(diǎn)，提供 “開發(fā) + 驗(yàn)證” 全流程一站式服務(wù)，依托 UPLC-MS/MS、制備色譜等高精度設(shè)備，結(jié)合自主研發(fā)的多柱篩選、梯度優(yōu)化技術(shù)，可解決 “方法難開發(fā)、驗(yàn)證不達(dá)標(biāo)、數(shù)據(jù)不可靠” 等問題;同時(shí)其推出的反相 C18-AR 色譜柱、Phenyl 苯基柱、CN氰基柱、SEC-Bio 色譜柱等產(chǎn)品，可適配多肽藥物不同分離場(chǎng)景需求，助力企業(yè)突破技術(shù)瓶頸，確保方法科學(xué)、準(zhǔn)確、合規(guī)落地，為多肽藥物研發(fā)與生產(chǎn)的質(zhì)量控制提供有力支撐。?
發(fā)布于: 2025-10-08